细胞功能检测-欧易生物

MTT、CCK8法

MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称，商品名为噻唑蓝。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

CCK8法原理是WST-8四唑盐（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)- 3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）能被活细胞内的脱氢酶还原成橙色甲臜染料，

然后测定450 nm下的吸光值，生成的甲臜的量与活细胞数量成正比。

CCK8法可以做6天左右的生长曲线，1-6天每天收取细胞样本检测。

也可以类似MTT法，在相同时间比较不同处理组。

BrdU、EdU法

BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，

可以代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，

这种置换可以稳定存在，并传递到子细胞中。

细胞经固定和变性处理后，可以用免疫学方法检测DNA中的BrdU的含量，从而判断细胞的增殖能力。

EdU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，

能够在细胞增殖过程中代替胸腺嘧啶插入正在复制的DNA中。

EdU与荧光染料可以特异性地反应检测DNA的复制。

CFSE检测

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，

具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺酯基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团。

CFSE被细胞吸收后，不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到蛋白质上。

随着细胞增殖分裂，细胞内CFSE的含量被平均分配到两个子细胞中，子细胞荧光强度减半。

随着细胞的增殖，CFSE不断被稀释，使用流式细胞仪对CFSE进行检测，可以对细胞的增殖进行分析。

免疫组化检测

使用免疫组化的方法对细胞增殖相关抗原-Ki-67、PCNA进行检测。

这类标志物只表达在增殖细胞中，常用于反映体内肿瘤细胞的增殖能力。

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细胞克隆形成

细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。

每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。

集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。

通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

细胞迁移

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。

细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。

细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。

Transwell检测

Transwell的基本原理是将transwell小室放入培养板中，

小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。

将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

细胞侵袭

细胞侵袭是指细胞向局部侵犯，细胞侵袭实验可用来研究细胞和胞外基质之间的相互作用。

胞外基质不仅为细胞提供了结构支架，同时也包含了许多细胞生存及生长过程中生物功能因子。

细胞可以分泌酶，用于降解胞外基质中特定的组分，从而使细胞可以在细胞间质中移动。

胞外基质胶模仿体内细胞外基质胞外基质环境，包含了支撑细胞结构的最基本的组分。

转移性肿瘤细胞由于其高迁移和/或降解胞外基质的酶活从而表现出较强的侵袭性。

Transwell检测

铺有 Matrigel 胶的 Transwell 小室可用于检测细胞侵袭能力。

Transwell的基本原理是将transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以铺有 Matrigel 胶聚碳酸酯膜相隔，

Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，

铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

滤膜孔径一般为8 μm，而且膜孔都被Matrigel覆盖

，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。

铺有Martrigel的滤膜放在以细胞小室上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，上室加入重悬的瘤细胞，

具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。

肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。

细胞凋亡

Annexin V-PI双染色流式检测

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，

而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

AnnexinV是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力，

故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用，通过流式细胞仪检测可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

Caspase3活性检测

Caspase3是细胞凋亡最重要的执行蛋白之一，对其功能/活性的检测可以反映细胞的凋亡情况。

可以使用Western Blot检测细胞中Caspase3蛋白的表达水平或者使用流式细胞仪检测细胞群体中Caspase3阳性细胞的比例。

细胞周期

PI（碘化丙啶）染色

细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。

间期又分为三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 与 DNA 合成后期 ( G2 期 )。

某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能 ( G0 期 )。

由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同，通常正常细胞的 G1 / G0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍体细胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。

PI可以与 DNA 结合，其荧光强度直接反映了细胞内 DNA含量。

因此，通过流式细胞仪 PI 染色法对细胞内 DNA 含量进行检测时，

可以将细胞周期各时相区分为 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。